<source id="ih6uu"></source>
      1. <i id="ih6uu"></i>

        <acronym id="ih6uu"></acronym>
      2. 產品課堂

        關于大容量錐形離心瓶在科研實驗中應用問題的討論

               Conical Centrifuge Tubes或Conical-bottom Centrifuge Bottles,因瓶體長度中近三分之一呈圓錐形,故稱作錐形離心瓶、尖底離心瓶。

               通常,組織培養實驗中胰蛋白酶消化后的活細胞離心,分子生物實驗中細菌離心收獲(harvest)及大容量組織勻漿或細胞裂解液的澄清(clarifying)等常規中低速實驗,依托臺式離心機即可實施操作。而錐形瓶因底部特殊造型,有利于樣品組分離心形成的顆粒物(pelleting)聚集分布在瓶底錐間一小塊區域,對最大程度收集沉淀或傾倒上清十分方便,因此深受實驗人員喜愛。

               工作中我們注意到,對錐形離心瓶的使用,可能還存在一些認識上的誤區,技術上也有亟待掃除的盲點。為此,本篇嘗試從離心機轉頭工作原理、錐形離心瓶外形特點與實驗應用要求三個角度,探討錐形瓶在科研實驗中應用方法這一問題。

        一、錐形離心瓶的運用是否不可替代?

               要澄清這一問題,需要從錐形離心瓶在水平轉頭和定角轉頭兩種離心模式下對其樣品組分沉淀生成原理加以具體分析。

        圖1. 水平轉頭離心沉淀在平底、尖底瓶中分布位置對比.jpg

               如圖1所示,當采用水平轉頭離心時,樣品組分粒子在數百至數千倍重力的離心力作用下,克服液體的阻力水平方向發生沉降運動。大部粒子前進、深入離心瓶錐體后,會遭遇瓶壁的阻擋。而此時,水平方向的離心力可人為分解成方向垂直于錐體側壁和平行于錐體的兩個分力。粒子沉降方向變化,將緊貼、沿著瓶壁向外側繼續遷移。這將使瓶底部樣品粒子密度激增,進而粒子聚集形成有形顆粒而沉淀。

               在錐形瓶底的約束和強大的離心力作用下,沉淀顆粒向下、向外遷移而堆積集在錐頂一狹小區域內。而在平底(Flat-Bottom)或圓底(Round-Bottom)離心瓶中,粒子可保持水平方向沉降直至瓶底,因此,沉淀顆粒物可散布至整個瓶底范圍。

               對于需要回收沉淀組分的應用,如培養的酵母菌、細胞等,沉淀分布越集中,越利于完整回收,減少損耗。而對于細胞器制備中采集上清、去除死細胞及細胞碎片組分操作,平底瓶中沉淀過于分散,傾倒上清過程中往往容易有沉淀顆粒被液流蕩滌裹挾而混入。為避免沉淀污染而廢棄瓶底部分上清,必造成上清損失。因此,水平離心操作應用中,采用錐形瓶有助于實現樣品高回收率。

               離心瓶若采用R10A5、JLA-10.500等固定傾角轉頭離心,則情況有所不同。

        圖2.角轉頭中離心平底、錐形瓶的沉淀分布位置.jpg

               如圖2所示,將兩種離心瓶置于具有26°傾角的角轉頭R10A5中離心時,在300×g RCF及更高RCF離心條件下,樣品顆粒形成后會趨向離心瓶的最大離心半徑處聚集。錐形和平底兩種離心瓶中生成的沉淀均呈局限性分布。

               理論上,轉頭傾角(通常為20°- 30°范圍)增大,則兩款離心瓶中沉淀斑的重心將靠近瓶壁、瓶底交界線,沉淀分布范圍擴散。平底離心瓶的最大離心半徑處呈90°夾角,而錐形瓶相應位置的瓶體夾角近135°。相同樣品離心條件下,平底離心瓶中沉淀斑塊要比錐形瓶內的小且厚實。

               可見,錐形瓶無論是在水平轉頭、角轉頭中離心,都具有沉淀分布局限化的特點。但這并非錐形瓶的專利。將平底離心瓶置于角轉頭中工作時,也可產生與錐形瓶水平離心近似的分離效果。

         

        二、錐形瓶主要適用于中低速離心?

               從病毒樣顆粒(Virus-Like Particles,eVLPs)、腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)載體分離到干細胞的分離,從化合物抗菌活性研究到蛋白翻譯后修飾、染色質相關蛋白復合物(protein components of chromatin associated complexes)分析等眾多科研實踐中,人們將錐形離心瓶用于細菌、酵母菌、sf9昆蟲細胞、哺乳動物細胞及模式生物秀麗隱桿線蟲的大規模培養后的收獲操作。

        表1 品牌錐形離心瓶實驗應用報道舉隅

        實驗樣品

        離心參數

        所用錐形瓶

        所用離心機轉頭

        文獻號

        人胎盤解離液

        (分離細胞滋養層細胞)

        500×g - 20min

        NUNC 200mL瓶 376813

        -

        1

        人體脂質抽吸物

        (分離基質血管組分, SVFs)

        800×g - 5min

        Falcon 225mL瓶 352075

        -

        2

        小鼠J1 ES胚胎干細胞培養物

        2400×g - 15min

        Corning 250mL瓶 430776

        JS 4.2甩平轉頭

        3

        hog1Δ cells細胞培養物

        1819×g - 3min

        Corning 250mL瓶 430776

        H6000A甩平轉頭

        4

        293F細胞培養物

        2000×g

        Corning 500mL瓶 431123

        Sorvall Legend XTR離心機

        5






        Sf9昆蟲細胞培養物(94–001F)

        800×g - 10min

        Corning 500mL瓶431123

        -

        6






        釀酒酵母菌VL6-48培養物

        1860×g - 5min - RT

        Falcon 225mL瓶352075

        SLA-1500角轉頭

        7

        硫酸鹽還原菌培養物

        (D. desulfuricans ATCC 27774)

        6766×g - 20min - 4 ℃

        Corning 250mL瓶430776

        JS-4.2甩平轉頭

        8

        膿腫分枝桿菌培養液

        (Mab ATCC 19977)

        3220×g - 10min - 4 ℃

        Nunc 200mL瓶376813

        -

        9






        大腸桿菌培養物

        (除去XL-1 Blue菌液上清)

        3000×g - 15min - 4℃

        Falcon 225mL瓶352075

        J6-M1離心機

        10

        添加PEG的培養液上清

        (沉淀噬菌體顆粒)

        15000×g - 15min - 4℃

        Nalgene 250mL平底瓶

        Avanti J-E or

        Avanti J-26 XP離心機

        FreeStyle 293-F

        ExpiCHO-S細胞培養液

        500×g - 10min - 4 ℃

        Corning 250mL瓶430776

        Avanti J-26 XP離心機

        11

        澄清處理后的細胞培養液上清

        (除去細胞碎片)

        10000×g - 20min - 4℃

        HEK293細胞培養物

        (用于分離純化rAAV)

        2000rpm - 10min - 4℃

        Corning 250mL瓶430776

        -

        12

               資料表明,從大量的酵母菌、厭氧菌、大腸桿菌、秀麗隱桿線蟲、組織細胞及蛋白真核細胞表達系統等起始材料中提取質粒、細胞核、蛋白、病毒類顆粒時,大容量錐形離心瓶的使用可為操作提供極大方便。

               哺乳動物細胞、昆蟲細胞培養物的收獲離心操作常用RCF 200 - 2000×g的設定。培養菌體的收集時RCF設置以1800 - 3000×g居多。

        但錐形離心瓶并非如只能進行RCF 7000×g以下的中低速離心。根據文獻11報道,Corning 250mL錐形瓶(430776)在高達10000×g RCF條件下正常工作是可行的。事實上,Nalgene、Nunc等廠商為高速離心應用提供了可耐受RCF 10000xg離心的錐形瓶。就文獻10和11實驗應用而言,條件許可時,采用Nalgene 3144-0175、3143-0175兩款175mL錐形離心瓶完全可行。

               因此,在大規模質粒和蛋白提取、外泌體等細胞器的差速離心分離、噬菌體PEG分離等應用中,大容量、高速錐形離心瓶的引入將給操作流程帶來事半功倍的效果。

         

        三、錐形離心瓶運用需面臨的問題

               錐形離心瓶下部為錐體造型,在瓶體外徑、帶蓋工作高度相同情況下,錐形瓶的有效容量低于常規平底離心瓶。將Corning 430776錐形離心瓶(250mL;59.7×161 mm)與Nalgene 3120-0250平底離心瓶(250mL;61.8×125.2 mm)、Corning 431841旋蓋離心瓶(250mL;60×128 mm)對比,一眼便知。

        圖3. 250mL錐形離心瓶與平底離心瓶外形尺寸的對比.jpg

               而錐形瓶要扭轉容量上的相對劣勢,只能從增加瓶體的高度或(和)瓶體直徑這兩方面挖掘潛力。以500mL 的Corning 431123錐形離心瓶(95.5×146.8 mm)為例,其瓶身遠比相同容量的Corning 431846密封蓋離心瓶(69×170 mm)、Nalgene 3120-9500離心瓶(69.5×158.9mm)粗,已達到1L Beckman C31597離心瓶(96×191mm)和Himac 1000PP廣口離心瓶(98×170mm)的體量。

               瓶體高度增加或直徑加大,使錐形瓶無法用于針對相同通量平底離心瓶尺寸設計的轉頭。事實是:

        1)額定容量250mL的Nalgene或Corning錐形離心瓶,無法安裝到6×250mL角轉頭中離心;

        2)無論是5804R離心機S-4-72水平轉頭,或5810RA-4-62水平轉頭,轉頭配套的250mL離心瓶適配器只能承載Nunc 200mL (376813)、Falcon (352076)錐形瓶;

        3)500mL 錐形瓶,不適用于4×500mL的A-4-81水平轉頭,只能在Multifuge-X4R proTX-1000TX-750、5810R的S-4-104水平轉頭以及Avanti J-HC的JS-4.2等4×750mL及4×1000mL的大容量水平轉頭上使用。

        因此,錐形離心瓶的使用不如平底離心瓶靈活,它對工作離心機配置資源是有技術門檻限制的。

         

        四、錐形瓶離心運用的離心機資源條件

               錐形離心瓶正常工作需要有工作容量可與之匹配的離心機、轉頭及錐形瓶相應適配附件配置做支撐。

        4.1 離心機主機平臺的性能要求

               若是常規培養細胞、菌體離心收獲或收集上清,轉頭Max RCF達到3000-4000×g能滿足操作要求,則配置4×250mL及更大容量水平轉頭的臺式離心機,即具備錐形離心瓶使用基礎條件。

        表2 常用品牌錐形離心瓶工作RCF參數表

        錐形瓶品名

        品牌

        型號/貨號

        可耐受最大RCF

        250mL錐形離心瓶

        Nunc

        376814

        10000×g

        200mL錐形離心瓶

        Nunc

        376813

        7100×g





        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3144-0175

        27500×g

        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3143-0175

        27500×g

        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3145-0175

        5800×g





        250mL錐形離心瓶

        Corning

        430776

        6000×g

        500mL錐形離心瓶

        Corning

        431123

        6000×g





        175mL錐形離心瓶

        Falcon

        352076

        7500×g

        225mL錐形離心瓶

        Falcon

        352075

        7500×g

               文獻報道中常用的Falcon 175mL錐形瓶352076,外徑60.7mm,帶蓋總高度120.4 mm,可與多數主流品牌臺式離心機的4×250mL水平轉頭兼容。如Multifuge X1R ProTX-400轉頭(4×400mL/62×135 mm/4696×g)、eppendorf 5804R的S-4-72轉頭(4×250mL/62×130mm/3234×g)、Sigma 3-16K或3-18K的11180轉頭(4×400mL/62×139.2mm/4200×g),Allegra X-30R配備的SX4250(4×250mL/61.6×125mm/3900×g)等,均具有支持Falcon 175mL錐形瓶離心的能力。

               若樣品離心力要求高(如RCF超過5000×g),雖然仍處于離心瓶的安全離心力限度范圍,但符合實驗要求的臺式機轉頭稀缺。此時,Avanti J-E、Avanti JXN-26、Himac CR22N、Sorvall LYNX 4000等大容量立式離心機是較理想的解決方案。就Falcon 175mL錐形瓶而言,如立式離心機中的Avanti JXN-26JLA-16.250角轉頭和JS-7.5水平轉頭(4×250mL/62×136mm/10400×g)、Avanti J-EAvanti J-26S XP離心機的JLA-16.250角轉頭或JS-5.3 ALLSPIN水平轉頭(4×500mL/6670×g)、Himac CR22NR14A、Sorvall RC-6 Plus的SLA-1500角轉頭都可作為資源選項。

         

        4.2 轉頭工作容量的要求

               錐形離心瓶比同等容量的平底離心瓶要高,除去Falcon 352076、352075兩款錐形瓶,Corning 250mL錐形瓶、Nunc 200mL錐形瓶及Nalgene 175mL錐形瓶都均無法在目前在產標準6×250mL角轉頭中安裝,只能在6×500mL、4×1000mL、6×1000mL大容量角轉頭或工作容量4×500mL、4×750mL及4×1000mL水平轉頭中使用。

               這使得離心機常規實驗應用定制的容量轉頭和配置方案,很可能無法滿足實驗室現有錐形瓶運行要求。如Mutifuge X4R Pro離心機的F14-6x250LE角轉頭(6×250mL;62×125 mm)、eppendorf 5804R的S-4-72水平轉頭(4×250mL; 62×130 mm),5810R的A-4-62水平轉頭(4×250mL;62×136 mm)等,都面臨這一問題。

         

        4.3 錐形瓶適配附件的要求

               錐形離心瓶無論在何種轉頭上使用,均須用離心機轉頭配套錐形瓶專用適配器或離心瓶制造商提供的離心瓶適配器(centrifuge Bottle adapter)或瓶墊(centrifuge Tube cushion,Bottle insert,Bottle cushion)墊于瓶底。

               不同離心機制造商、轉頭可提供的配套適配件功能類型不盡一致。

               錐形瓶與轉頭可有兩種工作組合模式。

               一種是角轉頭常用的圓底瓶適配器+錐形瓶墊+錐形瓶模式。此模式是先在角轉頭離心孔底安裝平底離心瓶適配器,適配器上方疊放錐形瓶墊,最后將離心瓶安裝在瓶墊上。250mL錐形瓶在Avanti JXN-26立式離心機JLA-10.500角轉頭(含362750適配器)、Himac CR22N離心機R10A5角轉頭和Sorvall LYNX 6000 F12-6x500LEX角轉頭(含010-0152適配器)上離心,均屬于這種模式。

               第二種是水平轉頭用的離心瓶+錐形瓶專用適配器模式。這就需安裝離心機制造商專門為錐形瓶量身定制的錐形瓶適配器。專用錐形適配器的外部與平底離心瓶底部尺寸一致,可與轉頭離心孔底部緊密貼合。其內面為錐形,與錐形瓶底部嚴絲合縫。Multifuge X4R Pro離心機的TX-1000和eppendorf 5810R的S-4-104轉頭,均自帶Corning 500mL錐形瓶適配器。將此適配器在吊籃中安裝就位后將錐形瓶插入適配器即可,無需使用Corning 500mL錐形瓶墊431124即可實現安全離心。TX-1000轉頭還可提供另一款適配器75005392,用于62×145mm尺寸瓶體,可兼容250mL Corning 錐形離心瓶、200mL Nunc 錐形瓶及175mL Nalgene錐形瓶。

        圖4 500mL錐形瓶-錐形適配器-水平轉頭組合工作模式.jpg 

        4.4 錐形瓶高度范圍的要求

               業內所標注的錐形瓶高度通常指的是離心瓶合蓋后總高度。不同品牌、型號和容量的錐形瓶高度存在差別。

        表3 品牌錐形離心瓶外形尺寸表

        品名

        品牌

        型號

        離心瓶尺寸(外徑×高度)

        175mL錐形離心瓶

        Falcon

        352076

        60.7×120.4 mm

        225mL錐形離心瓶

        Falcon

        352075

        60.7×139.4 mm

        250mL錐形離心瓶

        Corning

        430776

        59.7×161.0 mm

        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3143-0175

        61.8×139.4 mm

        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3144-0175

        61.8×140.5 mm

        175mL錐形離心瓶

        Nalgene

        3145-0175

        61.5×135.6 mm

        200mL錐形離心瓶

        Nunc

        376813

        59.9×137.2 mm

        250mL錐形離心瓶

        Nunc

        376814

        59.7×145 mm

               實驗者更應關注離心瓶的工作高度參數。

               錐形離心瓶的工作高度是指離心瓶與瓶墊或轉頭的錐形適配器組合后的總高度。通常,瓶-墊組合體的高度比離心瓶高度多出5-10mm。評估錐形離心瓶與工作轉頭時匹配程度時,瓶墊的增高作用不可忽略。

               不同品牌、型號轉頭適用的離心瓶高度范圍不一。

               錐形瓶的瓶蓋高近2.5cm,而直徑約為瓶體直徑的一半。手指捏緊瓶蓋即可輕松完成樣品瓶在角轉頭或水平吊籃適配中的裝卸。故錐形瓶的瓶體高度低于轉頭建議標高,并不妨礙離心操作。
               但瓶體工作高度超標情況則大為不同。忽視轉頭可接受的離心瓶工作高度上限強行上樣,輕則影響轉頭蓋或吊籃密封蓋的正確安裝,重則在轉頭啟動、吊籃向內側擺過程中,瓶蓋與轉頭軛部(Yoke)接觸而極易引發離心安全事故。
               因此,錐形瓶瓶體高度應秉持“從低不從高”的原則。

               無論哪種離心瓶與轉頭屬工作組合,錐形瓶離心操作只有在與離心機管理員、技術服務人員確認設備配置符合特定錐形瓶工作條件時方可進行。

        圖5 Nunc Corning Falcon錐形離心瓶及專用瓶墊.jpg 

        五、結語

               大容量錐形離心瓶的特殊外形設計,無論是用于角轉頭還是水平轉頭中工作,離心生成沉淀的分布集中,既方便傾盡上清又便于完整回收沉淀。RCF5000×g以內的中低速離心應用環境中,采用Corning、Falcon錐形瓶比常規平底離心瓶的成本優勢更顯著,且簡便易行。

               而當錐形瓶用于細胞器差速離心分離、大規模質粒提取純化、噬菌體提取等高達RCF 10000×g以上的離心實驗時,需有立式大容量高速離心機、500mL-1L角轉頭及配套適配器支持,雖分離效果與平底離心瓶趨近,但操作較為繁瑣。

               文獻10研究項目中,實驗者用Avanti J-E落地離心機的JLA-16.250(或JA-14)角轉頭,在250mL平底離心瓶以15000×g RCF工作轉速實現對培養菌體碎片的有效分離。這驗證了本文開頭的論點:角轉頭中離心時,平底離心瓶具有與錐形瓶同等離心效果。

         

        參考文獻

        [1]Arthur Colson, Christophe Louis Depoix, Corinne Hubinont, et al. Isolation of Primary Cytotrophoblasts From Human Placenta at Term. Bio Protoc. 2021; 11(19): e4185.

        [2]Ryoko Inaki, Yoshihiko Sato, Daisuke Nakamura, et al. Lipoaspirate stored at a constant low temperature by electric control suppresses intracellular metabolism and maintains high cell viability. Regen Ther. 2023; 24: 662–669.

        [3]Jianlong Wang, Alan B. Cantor, Stuart H. Orkin. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes in Mouse Embryonic Stem Cells Using In Vivo Biotinylation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2009; CHAPTER: Unit1B.5.

        [4]James P. Shellhammer, Elizabeth Morin-Kensicki, Jacob P. Matson, et al.   Amino acid metabolites that regulate G protein signaling during osmotic stress. PLoS Genet. 2017; 13(5): e1006829.

        [5]Grant C Weaver, Rina F Villar, Masaru Kanekiyo, et al. In vitro Reconstitution of B Cell Receptor Antigen Interactions to Evaluate Potential Vaccine Candidates. Nat Protoc. 2016; 11(2): 193–213.

        [6]Andrew B. Kleist, Francis Peterson, Robert C. Tyler, et al. Solution NMR spectroscopy of GPCRs: residue-specific labeling strategies with a focus on 13C-methyl methionine-labeling of the atypical chemokine receptor ACKR3. Methods Cell Biol. 2019; 149: 259–288.

        [7]Vladimir N Noskov, Ray-Yuan Chuang, Daniel G Gibson, et al. Isolation of circular yeast artificial chromosomes for synthetic biology and functional genomics studies. Nat Protoc. 2011; 6(1): 89–96.

        [8]Smaranda Craciun, Emily P. Balskus. Microbial conversion of choline to trimethylamine requires a glycyl radical enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(52): 21307–21312.

        [9]Gregory A. Phelps, Martin N. Cheramie, Dinesh M. Fernando, et al.  Development of 2nd generation aminomethyl spectinomycins that overcome native efflux in Mycobacterium abscessus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024; 121(2): e2314101120.

        [10]Aftabul Haque, Nicholas K. Tonks. Use of Phage Display to Generate Conformation-Sensor Recombinant Antibodies. Nat Protoc. 2012; 7(12): 2127–2143.

        [11]Jeffrey M. Schaub, Chia-Wei Chou, Hung-Che Kuo, et al. Expression and characterization of SARS-CoV-2 spike proteins. Nat Protoc. 2021; 16(11): 5339–5356.

        [12]Sean M. Crosson, Peter Dib, J. Kennon Smith, et al.Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018; 10: 1–7.

         

        亚洲gv天堂无码男同在线观看_又黄又爽又湿又免费视频_丁香五月缴情综合网_少妇无码av无码专线

        <source id="ih6uu"></source>
          1. <i id="ih6uu"></i>

            <acronym id="ih6uu"></acronym>