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      2. 產品課堂

        好惡不相似,是非無太明——關于微需氧工作站應用技術問題的討論

               微需氧菌(microaerophilic bacterium)是指能在3% - 15% (v/v) 氧氣含量環境下生長、在20-21%氧含量大氣及無氧環境中生長受抑制細菌的統稱。除了空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni )、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,HP)等報道較多的人體致病菌外,還包括腸道中微需氧型雙歧桿菌,淡水、海洋硫化物等沉積物及廢水生物膜中硫酸鹽還原細菌(Sulfate-Reducing Bacterial, SRB),Zetaproteobacteria代表的近岸海洋沉積物、海底熱液環境中的嗜中性微需氧鐵氧化菌(FeOB)及從溫泉中分離的微需氧菌等多種寄生菌。

               微需氧菌常在含5%-O2,10%-CO2和85%-N2的氣體環境、28- 42℃溫度下培養。培養方法有玻璃缸蠟燭培養法、氣囊培養法、厭氧罐培養法(Anaerobic Jar)、三氣培養箱法(multigas incubator)和微需氧工作站(Microaerobic Workstations)培養法等。

        燭缸培養法和氣囊培養法難以穩定維持的氣體含量。

               厭氧罐培養系統由氣瓶、氣體控制單元和培養罐組成,具有充排氣的氣體置換、氧氣(1%-15%)和CO2(5%-15%)濃度的自動控制功能,可提供穩定低氧培養環境。系統無法調控培養罐工作溫度,故須將培養罐置于恒溫培養箱、生化培養箱或霉菌培養箱中培養。

               三氣培養箱(multigas incubator)具備常規微需氧菌培養所需的O2(1% - 18%)、CO2(0% - 20%)、溫度(RT+5℃ - +50℃)及濕度控制條件,但缺少樣品準備環節低氧操作環境。

               微需氧工作站集O2、CO2及溫濕度自動控制功能于一體,既是天然的低氧培養箱,又兼樣品制備的低氧環境操作臺,為微需氧菌實驗樣品制備、接種培養和檢測分析全流程的解決方案。既可置于普通實驗桌面工作,也可訂制專用工作臺架連同氣瓶、真空泵等輔助裝置安裝于實驗室一角運行使用。

               厭氧工作站和微需氧工作站兩者的整體結構基本一致,故有廠商將二者合稱厭氧/低氧工作站,寓意可一機兩用。事實上,二者的治氧目標、技術途徑、硬件配置及支持氣體均存在明顯區別。本文基于工作站的氣體環境調控機制來探討微需氧工作站軟硬件、配套氣體需求的特殊性,以便讀者在工作站的使用與選擇上胸有成竹。

        AG300 Plus和DWS M35微需氧工作站.jpg 

        一、微需氧工作站的艙內環境調控機制

               微需氧工作站的一個核心功能是將工作艙內空氣中氧分壓從20.9%降至5-6%的水平并長期維持穩定。在運行前,工作艙內充填的是空氣。

               若將空氣理想化為由O2-21%、N2-78.1%及1%其它氣體組成,無NO2、H2S、甲醛等有毒成份及塵埃污染的標準混合氣體。則無需將艙內氣體抽出一半后,僅輸入CO2、N2,即可使艙內氣體環境達到設定目標。

               但因地域、環境、氣候及天氣等條件影響,加之空氣中的塵埃及硫化氫、揮發性有機物(VOC)、NO2等有毒氣體污染的存在,為確保最終氣體環境一致性,標準流程應是先真空排出工作艙內空氣,再按氣體組成比例(如85%-N2:10%-CO2:5%-O2)輸入高純度工作氣體來完成氣體置換。

               在有氧呼吸鏈傳遞系統中,質子和電子的最終受體是O2。菌體從環境中攝取1mol O2可產生2mol水蒸氣。微需氧菌一方面攝入CO2,另一方面在有氧呼吸過程中消耗O2并排放代謝產物CO2和水蒸氣。微需氧菌攝取CO2的動機仍不十分清楚,但作為非固碳菌,理論上,培養過程中的排碳應高于固碳。最終結果是:工作艙內O2消耗低于CO2和水蒸氣的盡增長,氣體總量上升。

               微需氧菌通常需在含高濃度(5%-10%)CO2的氣體環境下培養。而系統根據O2、CO2傳感器檢測結果和控制算法,自動輸入相應流量的O2、N2,將O2、CO2的氣體分壓恢復至設定水平。通過自動泄壓裝置釋放部分氣體,可保持艙內氣壓的正常。無論是工作氣流輸入、艙內氣壓維持,全部由系統自動控制,無需人工干預。

               高純度的輸入氣體易造成培養基風干脫水。數字化濕度控制單元可控制直熱式水汽蒸汽發生器或艙外水汽霧化裝置,將艙內環境濕度維持在70% R.H.的默認值或更高(85-95% R.H.)設定水平。當艙內濕度超過設定值,系統則啟動除濕機制,風扇驅動艙內氣體循環,在流經半導體制冷控制冷凝器時,將水汽快速冷凝幫你改收集到艙外集水瓶中,從而降低艙內濕度。

               微需氧菌培養環境溫度通常高于20℃-26℃的室溫。系統通過升溫加熱和柜體自動對外輻射散熱的控溫機制,將艙內溫度(RT+5℃-+65℃)維持穩定。

               可見,在氣壓與溫濕度這幾個工作環境參數調控、真空泵運用方面,微需氧工作站與厭氧工作站基本一致。二工作艙內氣體環境調控的具體對象和調控機制,則存在根本區別。這就給微需氧工作站在配套體、硬件配置和系統控制層面都提出了不同要求。

         

        二、微需氧工作站運行配套氣體需求

               微需氧工作站艙要精確控制工作艙段O2、CO2兩種氣體的組成比例并保持穩定,必然要從外部引入O2和N2氣體。在已知CO2和水蒸氣分子總量盡增長背景下,為維持5%-O2、10%-CO2和85%-N2這一比例,O2輸入量必高于實際消耗量,同時補充N2。

               假設某個培養階段,工作艙內消耗了2體積的O2、新增1體積的CO2排放。則系統需輸入輸入2.69體積O2外加10.1體積N2,或直接補充12.81體積的壓縮空氣中(O2組成比例約21%),將艙內O2、CO2比例恢復??梢?,用單一壓縮空氣替代相對昂貴的N2、O2兩種純凈氣體用作艙內兩種氣體的補充來源方案,是經濟而可行的。

               工作站的操作過程保留了N2吹掃環節,以防外部空氣經樣品轉移艙、袖套窗口與艙內氣體對流而破壞艙內O2穩態。因此,標準微需氧工作模式下,工作站運行所需配套氣體為三種,即N2(轉移艙及操作袖套的N2吹掃)、CO2(在初始階段提供10%濃度的CO2)和壓縮空氣(正常工作狀態下艙內O2含量的維持)。這與厭氧工作站的N2+AMG、三氣培養箱的N2、CO2雙氣源供氣模式都不同。

               包括幽門螺桿菌和空腸梭菌在內,超過200種病原菌攜帶有氫化酶基因。氫化酶(hydrogenases)的作用在物種、不同菌株間存在差異。氫化酶不僅在微生物呼吸鏈中攝入的H2裂解成電子和質子,質子氧化產能產生PMF。一些腸道菌群還借助于氫化酶發酵產升H2,并在腸道組織中擴散和飽和。幽門螺桿菌呼吸鏈中PMF產生具有結腸微生物群產H2依賴性。鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌、簡易彎曲桿菌和幽門螺桿菌(包括致癌菌株)等幾種病原體,利用宿主結腸組織中分子氫為呼吸基質(respiratory substrate),對其生長和毒力表現至關重要。實驗證實,在培養氣體中添加H2,幽門螺桿菌菌體數量在16小時內實現40% - 60%的增長,且10小時內從[14C]碳酸氫鹽積累的碳增加了3倍。H2使得幽門螺桿菌在胃腸道定植(colonization)中保持關鍵的競爭優勢。

               微需氧菌培養中是否需引入H2問題,目前學界并無一致意見。但空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的培養氣體中添加H2的應用((5%-O2, 2%-H2, 88%-N2, 5%-CO2)早有報道。從目前公開報道看,多數微需氧菌實驗用的是三氣培養模式。

               加H2的辦法是在微需氧培養三組氣體基礎上增加一路H2-N2混合氣源。這樣,H2、N2、CO2和空氣構成了微需氧工作站的四氣工作模式。

         

        三、微需氧工作站的硬件配套要求

               厭氧工作站無論配置厭氧指示劑定性或氧氣傳感器定量監測,均可滿足O2含量控制在安全界限以下的調控要求。

               微需氧工作站在三氣模式下,要實時定量檢測O2、CO2兩種氣體含量,并根據傳感器讀數,自動調整壓縮空氣的輸入量,確保O2含量維持在設定值。而四氣工作模式下,則須在三氣應用配置基礎上增加H2傳感器及配套氣路控制單元。

               如采用肉眼觀察氧氣指示劑或氧氣傳感器讀數,人工計算、手工控制各種氣體的輸入量,容易出現操作失誤,以致艙內氧氣含量偏離設定范圍,危及樣品安全。多個參數手工控制方式,極大增加操作負擔,對操作者個人的經驗和操作熟練程度要求極高,不適用于大多數的實驗者。因此,微需氧工作站一般采用觸摸屏操作設置工作,系統通過PLC核心控制器,根據實驗設置集中對多環節、多參數自動化調控管理。市面上,DWS H35、江雪AG300 plus、Mini Station Plus、E500、E500G、QD500、E600,龍躍LAI-3T-N20、LAI-3DT等數字化自動控制的機型,是可以用作微需氧培養基礎架構的。

               微需氧氣體環境穩定須依托對多種工作氣體流量的精確控制。采用三氣運行模式的DWS H35、H25低氧工作站,設有N2、CO2和壓縮空氣三個獨立氣路接口,每個氣路的流量、啟閉都由系統獨立控制。而DWS M35微需氧工作站是標準四氣工作模式,內部氣路結構與控制模塊更為復雜。

               國產微需氧(低氧)工作站,一般基于標準厭氧工作站雙氣工作氣路結構(一個N2、一個AMG氣體)設計,標準配置下無法直接管控3-4種工作配套氣體。構建微需氧環境,須引入獨立外置氣體混合器模塊。氣路具體接入方法是:N2瓶與機身N2專用輸入接口直接連接;CO2、空氣及H2需與氣體混合器上相應氣體輸入接口連接,通過混合器輸出端口,與工作站的AMG輸入口對接。氣體混合器根據設置參數,可在多種氣體間切換和根據指令選擇性開放、關閉所需的氣體控制閥。

               當然,系統軟件首先得有CO2、空氣、H2參數控制界面入口。DWS H35低氧工作站操作界面無H2設置功能,可用于三氣模式下的微需氧環境控制,但不適用于四氣工作模式。

        DWS A35厭氧工作站與H35、M35微需氧工作站工作氣體參數設置界面對比圖.jpg 

        四、小結

               微需氧工作站集實驗樣品準備操作和培養于一體,有效彌補常規缸蠟燭培養、氣囊培養、厭氧罐培養及三氣培養箱的缺少樣品操作空間上的不足。工作艙內O2、CO2、H2、溫度、濕度等工作參數全自動、實時精確控制,是實現微需氧菌、微需氧寄生蟲(如藍賈第鞭毛蟲、陰道毛滴蟲等)、哺乳動物細胞低氧培養應用的標準化實驗工具。

               由于工作艙內氣體調控對象、目標方法的差異,微需氧工作站從系統控制軟件、艙內氣體傳感器配置種類、工作氣體的輸入與控制單元,與厭氧工作站的應用配置均顯著不同。一般說來,通過簡單的氣瓶更換,微需氧工作站可以秒變為厭氧工作站;但厭氧工作站要實現到微需氧工作站的絢麗轉身,單靠靠邁出切換氣瓶這一步還遠遠不夠。

         

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